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超声波在生物发酵工程中的应用

2009-3-21 22:18:00

由于发酵技术对环境的污染小、生产效率高,在轻工、化工和食品工业等领域广泛应用。随着发酵技术在轻化工和食品等行业应用的不断深入和拓展,对发酵技术本身的要求也越来越高。
一是传统的发酵工艺已越来越难以满足现代生物发酵工程的需要,迫使人们不断利用相关学科最新的科研成果来改进发酵工艺。迄今,一些物理量如光、电、热、 磁等对发酵过程生物学特性(如酶的活性等)的影响,人们已进行了一定的研究且取得了不少成果.近年来由于功率超声设备的普及和发展,超声波对发酵过程的影 响正引起人们强烈的兴趣和高度的重视.研究表明:合适强度的超声波作用于发酵液,可增加细胞膜的通透性和选择性,促进酶的分泌,增强细胞的代谢过程,从而 缩短发酵时间,改善生物反应条件,提高生物产品的质量和产量.由于国内生物反应设备研究和开发的滞后已严重影响生物技术的进一步发展,故利用生化工程的方 法,结合声、光、磁等手段研究新型生物反应器和专用设备,籍以提高生物反应的效率,对我国生化工程领域的发展尤显重要.
二是目前对发酵过 程参数的在线检测还缺乏有效的手段,这在一定程度上限制了人们对发酵过程动态特性的了解,也阻止了发酵技术的进一步发展。目前发酵过程中的一些物理化学参 数,如罐压、流量、温度、pH值、溶氧等均可在线测量;而一些生化过程参数,如基质浓度、发酵产物的浓度、发酵液的粘度等仍较难实现在线测量。究其原因, 主要是缺乏合适的在线测量传感器。近年来利用酶电极和光电技术已取得了一些成果,但在实际应用中仍存在较多问题。利用超声技术对发酵液的浓度和粘度进行动 态测量,不仅可以对发酵过程参数进行实时监控,而且可进一步研究发酵过程的动力学机制及发酵液的流变特性,进而科学地指导生物反应器内部结构的设计优化, 因此具有重要的理论意义和实际意义。
1.超声波作用于生物发酵工程的机理
应用于生物发酵工程的超声波可分为功率超声波和检 测超声波,功率超声波主要用于改进发酵工艺或改善发酵过程,其作用机制分为热作用、空化作用和机械传质作用,作用的强弱与超声波的频率及强度等有关。热作 用是超声波在介质内传播过程中,其能量不断地被传播介质吸收而使介质的温度升高的一种现象。在生物发酵工程中超声热作用可用于杀菌或使酶失活。空化作用是 超声波在介质中传播时,液体中分子的平均距离随着分子的振动而变化,当其超过保持液体作用的临界分子间距,即形成空化.超声波空化分稳态空化(声 强<10W/cm2)和瞬态空化(声强>10W/cm2)两种.瞬态空化绝热收缩至膨胀瞬间,泡内可产生高温高压 (5000K,50MPa),可破坏细胞结构或破碎细胞,使酶失活;稳态空化可使酶或细胞颗粒受到微声流产生的切应力作用。在生物发酵工程中,这一过程主 要发生在界面层、膜或细胞壁附近及细胞液内。机械传质作用是超声波在介质中传播时,可使介质质点进入振动状态,加速发酵液的质量传递,这一过程可发生在细 胞壁附近或细胞内,超声波可增强细胞膜及细胞壁的质量传递,进而提高发酵过程的反应速度,促进生物传质作用。
此外,微弱声波在液体介质中传播时,其传播特性(声速、传播衰减、辐射阻抗等)受介质性质的影响。因此,只要测得某一温度下液体的声速,即可求出液体浓度。在生物发酵工程中利用超声波检测技术可实现某些发酵过程参数的在线非接触测量。
2.超声波在生物发酵工程中的应用
2.1功率超声波的应用
2.1.1超声波应用于发酵工程上游技术 
基因工程是在基因水平上的遗传工程,即用人工方法把所需的某一供体生物的遗传物质(DNA)提取出来,在离体条件下剪切后,把它和载体的DNA分子连接 起来,然后导入某一受体细胞内,外来的遗传物质在受体内进行复制和表达,从而获得新品种。超声波的空化作用,可能导致空泡周围细胞的细胞壁和质膜的击穿或 可逆的质膜透性改变,使细胞内外发生物质交换,将外源基因导入细胞中,这种方法称之为超声波诱导基因转移法。Joer**o等[1]利用这种方法将外源基 因导入植物组织及原生质体内,获得了极高的稳定转化率。许宁等[2]1990年首次在国际上提出应用超声波诱导植物细胞基因转移的方法,并使用自制的超声 波诱导基因转移仪,取得了一系列的研究结果,以后他们又将此方法推广应用到哺乳动物细胞基因转移中,并对该方法诱导基因转移的机制进行了研究。丁志山等 [3]用24kHz、20W的超声波处理酵母原生质体,将外源DNA导入酿酒酵母原生质体中,获得了每微克DNA有103转化子的转化率,并发现酵母原生 质体的转化率受超声波处理时间的影响较大,如图1所示.刘春朝等[4]利用新型超声波生物反应器培养青蒿不定芽生产青蒿素,得到的青蒿素的产量分别为固体 培养和摇瓶培养的2.9和3.2倍.林炜铁等[5]利用超声波法破碎酵母细胞原生质体,研究了超声波在酵母细胞原生质体拆合技术中的应用,建立了一种新的 遗传育种方法。

2.1.2超声波应用于发酵工程中游技术 
低强度超声波依靠机械振动和稳态空化效应使传质边界层减 薄,并且使溶质粒子运动加速,这对于反应物进入酶或细胞活性部位及产物进入液体介质的传质扩散作用有利,可提高生物反应速度;适宜的低强度超声波作用于动 植物细胞时会产生胞内微流、胞内质的旋转及涡流运动,并且提高了细胞膜和细胞壁的穿透性,这些效应可以提高细胞的新陈代谢功能.图2是超声波生物发酵装置 原理结构图。关于这方面的研究工作国外开展得较早也相对较多,如:WOOD等[6]研究了废纸发酵生产酒精过程中,用超声波处理可使酒精产量提高近 20%;Matsuura等[7]研究了超声辐射对葡萄酒、啤酒和清酒发酵过程的影响,发现经超声辐射后葡萄酒和清酒中氨基酸的含量比对照组明显减少,从 而产生大量的高级醇,增加了酒香,并缩短了发酵时间;Stephen等[8]研究了超声波水浴作用下,α淀粉酶和糖化酶对淀粉和糖原水解活性的变化的影 响,发现在高强度超声波作用下,酶催化反应速率和转化酶对蔗糖的水解活性显著升高;Jackson等[9]研究了超声波处理对淀粉水溶性的影响,发现超声 波处理可增加淀粉在水中的溶解度;Toba等[10]研究了超声活化β乳糖苷酶催化乳酪中乳糖的分解情况,发现经超声波处理后,乳糖降解大大提 高;Azhar等[11]研究了在工业发酵中用马铃薯淀粉代替谷物淀粉时超声波的影响,发现超声波处理可引起淀粉颗粒的物理降解,导致淀粉糊表观粘度下 降;WangDZ等[12]研究了牛奶发酵中超声辐射的作用,发现超声辐射可促进乳糖的水解和细胞活性.

图2 超声波生物发酵装置原理结构图
Fig.2 The principle chart of ultrosonic bioreactor
国内这方面的研究工作虽然开展较晚,但也取得了不少成就.如:中科院化工冶金研究所研究了超声波在青霉素发酵过程中的应用,发现经超声波处理后,青霉素 产量可提高10%以上[13];林影等[14,15]研究了微超声波在脆壁克鲁维氏酵母菊糖酶发酵生产中的应用,结果表明:在20kHz、10W的微超声 波作用下,脆壁克鲁维氏酵母菊糖酶产量提高1倍以上;同时,他们还研究了超声波促进固定化菊糖酶催化作用的机理,结果表明,频率为20kHz、功率为 20W的超声波作用后,以蔗糖为底物的酶活力提高了60%;李柏林等[16]依据超声波作用原理,改变菌丝体胞壁对庆大霉素 (gentamicin,GM)的吸附性能,使部分被胞壁吸附的GM释放到发酵液中,研究表明运用超声波处理80~90h龄的发酵液可提高GM发酵效价 1.5倍;于淑娟等[17]对超声场下纤维素酶反应动力学进行了研究,结果表明,使用超声波催化法具有水解率高、产品质量好,以及优化反应条件等优点;高 大维等[18]研究了线性超声波辐射对啤酒酵母细胞生长的影响.此外,超声波处理还可改良发酵过程的生化反应*作条件,如溶氧、消泡等[19]。
2.1.3超声波应用于发酵工程下游技术 
在发酵产物的提取和分离中,离心和过滤是最常用的方法,传统的离心方法难以实现在线*作,而常规的过滤要使用各种各样的膜,这些膜过滤器使用时经常会被堵塞,因此需经常清洗或更换。超声过滤有如下特点:
1)可使溶液中的细胞(或微细颗粒)凝聚,提高过滤速度;
2)使细胞(或微细颗粒)部分地悬浮于液体中,从而为溶解成分留出更多的通道,可防止堵塞;
3)超声过滤无机械活动部件,不需要滤纸或滤膜.
在酿酒工业中,如果用超声波酒瓶装酒,3天后,普通的白酒就会变得如陈年佳酿,色香味俱佳。这种酒瓶的工作原理是:酒人瓶后,打开开关,瓶底的陶制振动 板立即开始振动,并发射出低频声波,若连续照射3天,瓶中酒呈熟的状态,水和酒分子搭配如多年陈酿,即6个水分子包围着1个酒精分子的稳定状态,从而使酒 味醇美,且不易醉人[20]。
2.2检测超声波的应用
当微弱超声波信号在发酵介质中传播时,其能量不足以对发酵液中细胞或 酶的生化性能或生物学性能产生影响,但发酵液的一些物理参数(如发酵产物或底物的浓度、发酵液的粘度等)的变化会改变超声波的传播特性,如超声波的传播频 率、声速、传播损耗等.由此可利用在发酵液中传播的超声波的声学特性变化来监测基质浓度、发酵产物的浓度或发酵液的粘度等参数.在温度一定时,酵母浓度的 变化对声传播速度的影响较大.

图3 酵母浓度测量实验装置图
Fig.3 Ultrosonic sensor using on measuring the yeast concentration
3.结语
超声波可广泛应用于生物发酵工程,不同频率和强度的超声波对发酵过程的作用是不同的,使用时应视具体的发酵工艺和使用条件进行选择。尽管人们在利用超声 波技术改造传统的生物发酵过程方面已进行了一些研究,但有关的应用基础研究还相当欠缺,特别是相应的超声波生物反应设备和超声波生物传感器的开发研究几乎 是空白。另外,利用超声波技术系统地研究工业微生物遗传性状,以及细胞结构与工业性能的改良,尚未见报导。目前国内的生物技术领域急需多学科和多种技术 (生物化学、生物物理、电子学、材料科学、计算机技术等)的相互交叉渗透,通过开发新型的生物反应设备与先进的工艺来推动生物技术的发展,尤其是利用有效 生物物理手段,籍以研究生物反应的机理并提高生物反应的效率,这对我国生物发酵技术的发展具有重要的意义。

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