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流式细胞术的常用样品制备方法

2013-6-22 14:17:00

  酶处理法:

 此法是实体组织分散为单个细胞的主要方法。由于不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异消化作用,所以应根据所用组织类型确定使用酶的种类。此外,乙二胺四乙酸(EDTA)能结合组织中的二价钙离子和镁离子,而二价钙离子和镁离子有维持细胞表面完整性和维持细胞间质结构的作用,因此,几种酶和EDTA联合使用有助于充分消化实体组织,提高细胞产出效率。下面仅介绍组织消化的一般过程,对于每种组织消化时所用的具体步骤需参考该组织细胞培养时的消化方法。

1.将组织剪成l~2mm3左右的小块

2.用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块,胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织,如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为0.1%~0.5%。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0.25%胶原酶,胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强,它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为0.1~0.3ug/m1。用大于组织量30~50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37℃条件下消化组织,需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定,一般来说,胰蛋白酶需作用20~60分钟,胶原酶需4~48小时。在消化过程中,如发现组织块已分散而失去块的形状,经摇动即可成为絮状悬液,则可取出少量液体在显微镜下观察,可见分散的单个细胞和少量的细胞团,可认为组织已消化充分。

3.消化完毕后,将细胞悬液通过100目孔径尼龙网或不锈钢网滤过,以除掉未充分消化的组织。

4.已过滤的细胞悬液经800~1000rpm低速离心5~10分钟后,弃上清液,加PBS液,轻轻吹打形成细胞悬液,细胞计数后即可使用。

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