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His-Binding-resin

产品货号:
供应商: 上海悦克生物科技有限公司
产品产地:
参考价格: 200 元
销售区域:
使用范围: 仅为制药设备或原料、科研使用,不能直接做用于人
产品参数
产品名: His-Binding-resin
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型号/货号:
产地: 商标:
销售地区: 价格: 200 元
产品特性: His-Binding-resin 纯化柱系采用进口填料分装而成,性质稳定、重复性好、使用简单、方便。胶粒平均直径100微米,比表面积大,结合大肠杆菌重组His-tag融合蛋白的能力大于20 mg/ml(30 kDa)。可以满足大多数实验室
信息有效期: [长期有效]    [更新时间:2009-10-25 15:04:53 ]
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His-Binding-resin 使用说明书
 
一、简介:
His-Binding-resin 纯化柱系采用进口填料分装而成,性质稳定、重复性好、使用简单、方便。胶粒平均直径100微米,比表面积大,结合大肠杆菌重组His-tag融合蛋白的能力大于20 mg/ml(30 kDa)。可以满足大多数实验室级别小量纯化His-tag融合蛋白的需求。
 
二、使用方法:
1.          离心收集500 ml表达目标蛋白的大肠杆菌,冻融或超声破菌于20 ml破菌缓冲液。破菌缓冲液: 20-50 mM Tris-HCl,pH 7.3-8.3,含0.25 M-0.5M NaCl,其它常用缓冲液为PBS。这一步可以适当加入PMSF作为蛋白酶抑制剂,但是不能使用EDTA。还原剂使用2 mM 2-ME,避免使用DTT,因为DTT会造成Ni/Co离子还原。
2.          离心取上清,上样于预先平衡好的纯化柱(10倍柱体积上样缓冲液平衡),通常自然流速可以很好结合。少数情况下,流速过慢,可以使用硅胶管控制上样速度。
3.          样品上完以后,使用破菌缓冲液洗柱10个柱体积,注意将纯化柱侧壁上的残留样品洗干净。
4.          使用10-20倍柱体积洗杂缓冲液将杂蛋白从纯化柱上洗去,如果杂蛋白太多可以加大洗杂体积。洗杂缓冲液:破菌缓冲液中补加咪唑到终浓度20 mM。咪唑可以使用上样缓冲液配制成500 mM母液,用前加入。
5.          洗杂结束以后,使用4-10倍柱体积洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱。通常目标蛋白会在第二个柱体积中开始流出。洗脱缓冲液:上样缓冲液中补加咪唑到终浓度200 mM。
6.          收集完成以后,使用10倍柱体积1% 醋酸冲洗纯化柱,再使用PBS/TBS平衡pH,大量蒸馏水水洗柱,最后加入5 ml 20%乙醇,保存在4 ℃,不要在-20 ℃冻结。
 
三、处理与再生:
His-Binding-resin可以多次使用,不需要再生。如果需要使用一根柱子纯化不同目标蛋白,或者长时间使用造成金属离子脱落,柱子堵塞、流速慢,可以按照下述方法进行再生。
1.          用0.1 M EDTA洗柱4倍柱体积,将金属离子洗脱下来,再用蒸馏水洗柱10倍柱体积除去EDTA残留。如果柱子堵塞严重,使用1% Triton X-100/PBS浸泡过夜。
2.          使用0.1 M盐酸洗柱4倍柱体积,10倍柱体积蒸馏水冲洗,再用0.1M 氢氧化钠洗柱4倍柱体积, PBS/TBS平衡pH,大量蒸馏水洗柱。这一步需要避免强酸、强碱洗柱时间过长。
3.          用4%氯化镍或者硫酸镍3倍柱体积重新螯合10分钟,也可以使用4%氯化钴或者硫酸钴螯合柱子,颜色不同,但是在使用效果上基本没有区别。
4.          柱子长时间不用,加入20% 乙醇,封口后于4摄氏度保存,避免干裂或者冻结。
 
四、补充说明:
1.          在未知His-tag融合蛋白稳定性的情况下,整个纯化过程最好在4℃完成,可以使用蛋白酶抑制剂防止降解,但是EDTA应当在纯化完成以后再加入。此外,可以使用非离子去垢剂改善结合,具体使用浓度参考以下:1% Triton X-100,1% Tween-20,0.03% SDS,0.1% NP-40。
2.          最好不同的融合蛋白使用不同的柱子,每根1 ml的His-Binding-resin亲和柱一次可以结合大约20 mg His-tag融合蛋白,样品较多,可以使用多根柱子。
3.          上样缓冲液中可以含有1 mM咪唑减少杂蛋白的结合,部分目标蛋白会在20 mM咪唑洗杂缓冲液中流出,所以对于新样品,每一步都要留样电泳,摸索纯化条件。
4.          如果融合蛋白是包涵体形式,那么可以选择变性纯化方法,通常是在缓冲液中加入8M 尿素以及去垢剂。变性纯化时一定要做好样品处理,不然容易造成柱子堵塞。变性方法得到的蛋白一般没有活力,可以用来制备抗体,但如想测定活力,就需要做复性。
5.          除了常规的咪唑洗脱方法以外,还有EDTA洗脱和pH梯度洗脱。后两种方法缺点明显,只在特殊情况下使用。
6.          可以使用在柱酶切的方法得到去除His-tag的目标蛋白。经常使用的酶包括:Thrombin;Enterokinase;TEV protease等。我们推荐TEV protease,因为这种酶的特异性较好,是带有His-Tag的重组酶,方便除去。在柱酶切可以提高产物纯度,但是空间位阻可能造成酶切效果不好,按照惯例,多数实验不用切除His-tag。
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